1. Визуализация альба-ДНК взаимодействий Для исследования архитектурных свойств белков Alba комплексы...
2. Кооперативное связывание Alba1
3. Alba1: Alba2 гетеродимеры не имеют кооперативного поведения связывания
4. Динамика и структура альба-индуцированного связывания ДНК

Визуализация альба-ДНК взаимодействий

Для исследования архитектурных свойств белков Alba комплексы Alba-ДНК были визуализированы с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) для различных белков: стехиометрии ДНК. Серия репрезентативных изображений для каждой стехиометрии показана в рисунок 1 , Комплексы были классифицированы путем визуального контроля изображений АСМ на «открытые», «соединенные мостом» или «сжатые» (раздел «Методы») и подсчитаны для различных стехиометрий ( Дополнительный рис. S1 ).

Рисунок 1: Альба соединяет и уплотняет ДНК.

Репрезентативные изображения комплексов Alba – ДНК, визуализированные с помощью АСМ. Плазмиды pRD24 с разрезом инкубируют при различных стехиометриях (обозначенных как димер: bp) с различными белками Alba. ( a - e ) Alba1 образует мостики в соотношениях 1:60 и 1:30, конденсирует молекулы в соотношении 1:15 и образует жесткие открытые молекулы ДНК в соотношении 1: 7,5. ( f - j ) Alba1: гетеродимеры Alba2 образуют мостиковые белково-ДНК-комплексы в 1:60, 1:30 и 1:15. Тем не менее, в соотношении 1: 7,5 молекулы ДНК сильно конденсированы и не имеют жесткой конфигурации, как Alba1. ( k - o ) Димеры Alba1 F60A способны образовывать мостики между дуплексами ДНК при всех различных концентрациях. У Alba1 F60A и Alba2 отсутствуют критический остаток F60 и его эквивалент. Идентичность последовательности α1-спирали, ответственной за димер-димерные взаимодействия в обоих белках, составляет всего 36%, что может объяснить различия между гомодимерами Alba1 F60A и гетеродимерами Alba1: Alba2. Масштабная линейка, 100 нм.

При соотношениях белок: ДНК 1:60 и 1:30 связывание димер: п.н. Alba1 приводило к образованию внутримолекулярных мостиков. В 1:30 димер: bp большинство комплексов Alba1-ДНК соединены (60%), из которых большинство содержит один белковый участок, простирающийся на часть молекулы ДНК ( Рис. 1с (слева), и даже некоторые молекулы ДНК оказались полностью соединенными (14% всех молекул) ( Рис. 1с , право). Обе эти особенности предполагают индуцированное ДНК кооперативное соединение, которое усиливается путем образования стабильных мостов. При повышенных соотношениях белок-ДНК (1:15 димер: п.н.) в одной и той же молекуле обычно наблюдается несколько сайтов мостиков, в результате чего молекула ДНК конденсируется ( Рис. 1г ). При еще более высоких соотношениях белок: ДНК (1: 7,5 димер: п.н.) молекулы ДНК приобрели открытый вид ( Рис. 1е ), предполагая усиление ДНК путем совместного параллельного связывания вдоль молекулы ДНК, как сообщалось ранее 24 ,

Чтобы исследовать роль границы димер-димер в кооперативном связывании бок о бок, мы изучили гетеродимеры Alba1: Alba2. Поскольку в субъединице Alba2 отсутствует консервативный интерфейс димер-димер F60, можно ожидать, что кооперативность будет подавлена. Связывание гетеродимеров при соотношениях белок-ДНК 1:60 и 1:30 димер: п.н. приводило к внутримолекулярным мостикам, как это видно на примере Alba1 дикого типа ( Рис. 1g ). Однако изображения показывают, что гетеродимеры не проявляют того же кооперативного поведения, что и гомодимеры Alba1, поскольку ни одна из молекул не была полностью соединена. При увеличенных соотношениях белок: ДНК (1:15 димер: п.н.) наблюдались относительно более мостиковые и конденсированные молекулы ( Рис. 1i ). В отличие от гомодимеров Alba1, в концентрации 1: 7,5 димер: п.н. все комплексы ДНК были сильно конденсированы, а не застыли ( Рис. 1j ), что указывает на снижение кооперативности между соседними димерами по сравнению с гомодимерами Alba1.

Поскольку было показано, что остаток F60 отвечает за кооперативное связывание бок о бок, мы изучили ДНК-связывающие свойства мутанта Alba1 F60A. 24 , Связывание мутанта Alba1 F60A в концентрациях 1:60 и 1:30 димер: п.н. дало внутримолекулярные мостики, сравнимые с комплексами белок-ДНК Alba1: Alba2 ( Рис. 1 л ). Конденсация ДНК наблюдалась при увеличении соотношения белок: ДНК ( Рис. 1 н ). Жесткие и открытые молекулы, как с белком дикого типа, никогда не наблюдались. Эти результаты подтверждают важность димер-димерных взаимодействий для кооперативного параллельного связывания и существенную роль остатка F60 в них.

Опубликованные эксперименты АСМ дают нам снимки комплексов Alba-ДНК при различных стехиометриях. Однако, чтобы получить количественное представление о свойствах связывания и связывания ДНК Alba, мы провели динамические измерения на отдельных молекулах ДНК в растворе, используя несколько различных конфигураций оптического захвата.

Механические свойства комплексов Alba1 – ДНК

Сначала мы исследовали влияние Alba1 на физические свойства отдельных молекул ДНК. В этих экспериментах молекула ДНК захватывается между двумя оптически захваченными шариками и постепенно растягивается, пока регистрируется сила на молекуле ( Рис. 2а ), что приводит к кривой сила-расстояние (FD). Сначала кривая FD голой ДНК измеряется в качестве эталона ( Рис. 2б , черная кривая). Впоследствии ту же молекулу инкубируют с Alba1 и записывают новую кривую FD, чтобы измерить влияние Alba1 на физические свойства ДНК ( Рис. 2б , зеленые и пурпурные кривые). При низких концентрациях белка (1–100 нМ) наблюдалось межсегментное перекрытие (как отражено в многочисленных пиках силы на расстояниях, значительно меньших длины контура), которые в некоторых случаях могли нарушаться приложенным усилием ( Рис. 2б зеленая кривая). Однако в большинстве случаев мосты могут противостоять силам даже до 400 пН (максимальное усилие, которое может быть применено в нашем приборе), что указывает на чрезвычайно стабильные мостовые взаимодействия. В концентрациях, где молекулы ДНК были насыщены Alba1 (> 100 нМ), мостиков не наблюдалось ( Рис. 2б , пурпурная кривая). Вместо этого при небольшом растяжении требовалось меньшее усилие, чтобы растянуть белок-ДНК ( Рис. 2б (пурпурно-черная кривая), которая указывает на то, что присутствует меньше энтропийной энергии и что связывание Alba1 делает жесткой молекулу ДНК. Для количественной оценки наблюдаемого жесткости кривые FD были записаны в диапазоне концентраций белка (1–2000 нМ) и снабжены моделью расширяемой червеобразной цепной модели (eWLC) (уравнение 1). Длина контура ( L C) и модуль растяжения ( K 0) оказались постоянными в диапазоне измеренных концентраций ( Дополнительная таблица S1 ). Однако длина персистенции ( L P), которая является мерой гибкости ДНК, увеличилась до пятикратного более высокого значения при концентрациях белка> 100 нМ ( L P = 260 ± 30 нм для 2 мкМ Alba1 по сравнению с L P = 49 ± 2 нм для голой ДНК, см. Рис. 2с черные кружки). Увеличение длины персистентности подтверждает, что связывание с белками вызывает усиление ДНК, как это наблюдалось в наших экспериментах AFM ( Рис. 1е ). Чтобы исследовать влияние Alba на параметры скручивания ДНК (твист-растягивающая связь и жесткость при кручении), модель WLC с поворотом (уравнение 2) была подобрана к кривым FD, измеренным при 2 мкМ Alba1, с получением g 0 = −560 ± 100 пН. нм, g 1 = 19 ± 6 нм и F C = 31 ± 7 пН ( N = 10). Эти значения не показывают отклонения в пределах ошибки от значений голой ДНК 29 Это указывает на то, что Alba1 не меняет твист-стрейч-связывание ДНК.

Рисунок 2: Характеристика связывания Alba-ДНК в экспериментах по микроманипуляции ДНК.

( а ) Схема установки оптического захвата, используемой для экспериментов с одной и двумя ДНК. Четыре оптических ловушки генерируются с помощью одного лазера. Каждая ловушка управляется пьезо-управляемым зеркалом. Молекулы ДНК улавливаются (i-ii), тестируются (iii) и измеряются (iv) в многоканальной проточной ячейке. ( б ) Кривые FD для отдельных молекул ДНК без белка (черная кривая) в присутствии 10 нМ (зеленая кривая) и 2 мкМ Alba1 (пурпурная кривая). При 10 нМ Alba1 кривая FD показывает несколько пиков в силе до того, как молекула полностью вытянется, что указывает на то, что молекула ДНК соединена (мультипликационная вставка). В концентрации 2 мкМ Alba1 молекула ДНК становится жесткой (пурпурная кривая). ( c ) Длина персистентности ( L P), измеренная при различных концентрациях белка гетеродимеров Alba1, Alba1 F60A и Alba1: Alba2 (черные кружки, зеленые квадраты и пурпурные треугольники, соответственно). Длина постоянства получается путем подгонки кривых FD к модели eWLC (уравнение 1). Значение для голой ДНК оказалось равным L p = 49 ± 2 нм. Столбики ошибок представляют стандартную ошибку среднего. ( d ) Дробный охват гетеродимеров Alba1, Alba1 F60A и Alba1: Alba2 в зависимости от концентрации (черные кружки, зеленые квадраты и пурпурные треугольники, соответственно). Точки данных Alba1 подбираются с помощью модели МакГи-фон Гиппеля с кооперативным связыванием ( K = 380 ± 100 нМ − 1, ω = 260 ± 80, сплошная линия). Модель с аналогичными параметрами, но ω = 1 (пунктирная линия) хорошо описывает точки данных гетеродимеров Alba1 F60A и Alba1: Alba2, подтверждая отсутствие кооперативности. Столбики ошибок представляют стандартную ошибку среднего.

Кооперативное связывание Alba1

Кинетика связывания ДНК Alba1 на ДНК может быть извлечена из количества Alba1, связанного с молекулой, в зависимости от концентрации. Длина персистенции молекул ДНК, покрытых Alba1, достигла своего максимума около 100 нМ и оставалась постоянной до 2 мкМ, что указывает на насыщенность ДНК ( υ = 1). Фракционное покрытие ДНК рассчитывается по длине постоянства как функции концентрации Alba1 с использованием уравнения 5 ( Рис. 2d черные кружки). Используя сообщенное значение сайта связывания n = 5 п.н. 22 , 23 модель Макги-фон Хиппеля (уравнение 6) хорошо согласуется с рассчитанными уровнями покрытия связывания Alba1-ДНК ( Рис. 2d , черная линия). Подгонка дает константу ассоциации K = (4 ± 1) · 102 нМ − 1 и коэффициент кооперативности ω = (3 ± 1) · 102. Значение ω 1 подтверждает кооперативное связывание Alba1 вдоль ДНК, что наблюдается в экспериментах AFM и показано в более ранней работе. 24 ,

Alba1: Alba2 гетеродимеры не имеют кооперативного поведения связывания

Чтобы исследовать функциональные различия и взаимодействие между двумя гомологичными белками Alba, мы охарактеризовали влияние гетеродимеров Alba1: Alba2 на механические свойства ДНК. Функциональные и структурные последствия образования гетеродимера Alba1: Alba2 лучше всего количественно решать в отсутствие гомодимеров Alba1 и Alba2. При смешивании в соотношении 1: 1 - как в наших экспериментах - образуются только гетеродимеры 21 , Мы находим, что эти гетеродимеры увеличивают персистентную длину ДНК ( Рис. 2с (пурпурные треугольники), но в меньшей степени, чем Alba1. Воздействие гетеродимера Alba1: Alba2 на ДНК аналогично влиянию мутанта Alba1 F60A, что указывает на то, что остаток F60 играет существенную роль в кооперативном увеличении длины персистентности ( Рис. 2с , зеленые квадраты). Для количественной оценки этого эффекта мы определили фракционное покрытие как функцию концентрации белка для гетеродимеров Alba1: Alba2 и мутанта Alba F60A, используя уравнение 5 ( Рис. 2d , пурпурные треугольники и зеленые квадраты соответственно). Чтобы выяснить, согласуются ли обе кривые связывания с потерей кооперативности, мы построили модель Макги-Гиппеля (уравнение 6), используя полученную аффинность связывания для Alba1 ( K = 4 × 102 нМ-1), того же сайта связывания ( n = 5 п.н.), но без кооперативности ( ω = 1). Изотерма связывания Макги-фон Хиппеля с использованием этих параметров очень хорошо описывает как гетеродимер Alba1: Alba2, так и кривую связывания Alba F60A ( Рис. 2d пунктирной линией), подтверждая, что остаток F60 отвечает за кооперативные взаимодействия димер-димер. Мы также оценили влияние гетеродимеров Alba1: Alba2 в контексте распространенных гомодимеров Alba1 (в соотношении 1:20), с которыми можно столкнуться в ситуации in vivo. 21 , Однако при этом соотношении небольшое количество Alba2 не оказывало заметного влияния на кооперативное образование нити Alba1.

Динамика и структура альба-индуцированного связывания ДНК

Alba1 индуцирует межсегментные мостики при относительно низких концентрациях белка (1–100 нМ) ( Рис. 2б зеленая кривая). Однако при насыщающих концентрациях Alba1 (> 100 нМ) мостиковое соединение не наблюдалось. Межсегментные взаимодействия могут быть уменьшены из-за жесткости молекулы ДНК, тем самым уменьшая вероятность того, что два сегмента ДНК в одной молекуле приблизятся достаточно близко, чтобы образовать мостики. Чтобы проверить, является ли это причиной отсутствия мостов при высоких концентрациях Alba, мы исследовали взаимодействия между двумя отдельными молекулами ДНК, используя конфигурацию четырехкратной оптической ловушки. Мы инкубировали молекулы ДНК в 1 мкМ Alba1, чтобы полностью насытить их, и затем принесли две Alba1-ДНК в непосредственной близости, чтобы обеспечить образование мостика. Не наблюдалось никаких мостиковых событий, показывающих, что ДНК, покрытая Alba1, не способна взаимодействовать с другими нитями Alba1-ДНК. Это указывает на то, что отсутствие образования мостика не вызвано ужесточением ДНК, но вместо этого домены взаимодействия, необходимые для мостика, недоступны, когда белки взаимодействуют бок о бок с соседними белками.

Поскольку Alba1 F60A способен образовывать мостиковые белково-ДНК-комплексы в широком диапазоне концентраций, мутант является идеальным кандидатом для изучения альба-индуцированных мостиков. Динамика и структура мостика были исследованы с использованием двух молекул ДНК, расположенных в непосредственной близости, которые впоследствии были инкубированы с Alba1 F60A (100 нМ). После инкубации сила прикладывается к одному концу молекулы ДНК, оказывая равномерное усилие сдвига вдоль всех белок-опосредованных мостов ( Рис. 3а , вставка). Обычно сила на противоположной молекуле ДНК возрастает, что указывает на существование опосредованных белком мостиков ( Рис. 3а , черная кривая). Кроме того, резкое падение силы может быть зарегистрировано как разрыв мостов. Однако в большинстве случаев ДНК-мостики были способны противостоять силам сдвига не менее 400 пН ( Дополнительный рис. S2 ). Интересно отметить, что Alba1-мостики очень стабильны по сравнению с бактериальным ДНК-мостиковым белком H-NS, который способен выдерживать только ~ 25 пН в режиме сдвига с одинаковой скоростью вытягивания 4 ,

Две молекулы ДНК пересекаются и соединяются путем инкубации в 100 нМ Alba1 F60A. ( а ) Стрижка эксперимента. Одна из двух молекул ДНК растягивается со скоростью v (пурпурная нить), создавая равномерное усилие сдвига ( F ) по всем сформированным мостам. Сила возрастает на противоположной молекуле (черные точки данных) и расслабляется при разрыве комплексов белок-ДНК. Когда пурпурная молекула ДНК растягивается до ~ 14,5 мкм, сила также увеличивается на растянутой молекуле, возможно, вызванной мостиками внутри той же молекулы. ( б ) Эксперимент по расстегиванию молнии. Сила до 50 пН создается на первом мосту между двумя молекулами ДНК, перетягивая перпендикулярно молекулам ДНК со скоростью v . По мере разрушения комплексов белок-ДНК с течением времени длина ДНК между двумя шариками ( L ) увеличивается дискретными шагами. Гистограмма временного графика снабжена несколькими гауссианами, чтобы найти размеры шагов (правая панель), которые представляют расстояние между двумя соседними мостами.

Чтобы создать силу исключительно на первом белково-индуцированном мостике, мы выполнили эксперименты по расстегиванию молнии, в которых мы перетягивали перпендикулярно белково-индуцированным мостикам ДНК ( Рис. 3б , вставка). Для разрушения моста требовалось усилие до 50 пН. Разрыв моста приводит к увеличению общей длины ДНК между двумя шариками ( L ), что приводит к уменьшению измеряемой силы. Экспериментальные данные показывают четкое ступенчатое увеличение L , что указывает на события разрыва белково-опосредованных ДНК-мостиков ( Рис. 3б , черная кривая). Количество ДНК, которое выделяется при разрыве каждого белково-опосредованного моста, соответствует эффективному следу каждого моста. Поскольку соединение двух нитей ДНК требует выравнивания граней спиралей, высвобождение в ДНК, вероятно, будет соответствовать целому числу спиральных повторов (~ 10,5 п.н.). Для извлечения отпечатка мостовых пятен с каждым событием разрыва строится гистограмма длины ( L ) каждого временного следа, которая снабжается несколькими гауссианами ( Рис. 3б правая панель). Расстояние между этими пиками соответствует размеру шага и изображено на гистограмме, которая показывает отчетливый пик около ~ 20 п.н., соответствующий расстоянию двух спиральных повторов ( Дополнительный Рис. S3 ). Это указывает на то, что два соседних моста менее плотно упакованы, чем в сококристаллической структуре, где расстояние между двумя мостами равно одному спиральному повторению. 23 ,

Похожие